Dépistage rapide des variants du SRAS-CoV-2, un outil clé pour la surveillance de la pandémie

Configuration et conception

Cette étude observationnelle a été menée à l’hôpital universitaire 12 octobre (Madrid, Espagne), un troisième hôpital de référence pour l’analyse de la variante SARS-CoV-2. L’étude a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki, telle que révisée en 2013. L’approbation du Comité d’éthique de la recherche n’était pas requise, comme indiqué dans la loi organique 3/2018, du 5 décembre, relative à la protection des données et à la garantie de la numérisation. droits. Cette loi permet aux autorités sanitaires et aux institutions publiques habilitées à surveiller la santé publique de mener des recherches scientifiques sans le consentement de la personne concernée dans des cas d’importance exceptionnelle et de danger pour la santé publique.

En 2021, une analyse variable du SARS-CoV-2 a été effectuée de manière prospective sur la majorité des échantillons positifs initiaux, en fonction du nombre d’échantillons positifs obtenus lors des vagues de pointe et de la disponibilité des réactifs. Divers dépistages ont été effectués sur des échantillons prélevés dans les services d’urgence, les travailleurs de la santé, les hospitalisations et trois centres de soins primaires désignés comme sites sentinelles par les autorités locales de santé publique, couvrant un total de 22 semaines (1-11, 28-37). , 50 -52). Pendant les 30 semaines restantes (semaines 12 à 27 et 38 à 49), le dépistage des variantes a été effectué sur tous les échantillons primaires positifs.

Procédures d’étude

L’analyse des variants du SRAS-CoV-2 par RT-PCR a été réalisée à l’aide de différents tests de diagnostic en fonction de leur disponibilité et de leur utilité pour détecter les variants émergents. Les réactifs utilisés tout au long de l’étude sont présentés dans le tableau 1.

Les résultats ont été interprétés comme suit : variant alpha (fuite du gène S ou positif pour N501Y et del H69/V70) ; bêta/gamma (positif pour N501Y et E484K); delta (positif pour L452R); et Omicron (positif pour N501Y, del H69/V70 et K417N).

Le séquençage du génome entier (WGS), considéré comme la technologie de référence, a été effectué sur des échantillons qui avaient été précédemment analysés pour la variante par RT-PCR et avaient une valeur Ct inférieure à 25. La décision d’effectuer le WGS dépend également du nombre de résultats positifs. échantillons obtenus pendant les vagues de pointe et la disponibilité des réactifs. En conséquence, WGS a été exécuté sur 10,8% des échantillons soumis à l’analyse de variante SARS-CoV-2 par RT-PCR. De plus, lorsqu’il n’était pas possible d’effectuer le WGS sur tous les échantillons précédemment analysés par RT-PCR (pendant les vagues de pointe), la sélection des échantillons WGS était basée sur des critères aléatoires. Ce processus de sélection comprenait la représentation d’une grande variété d’échantillons. Le WGS a été réalisé à partir de l’échantillon d’origine à l’aide d’Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ou avec les plateformes du groupe ABL SA (Luxembourg/Ilumina, San Diego, CA, USA), en fonction de la disponibilité des réactifs (tableau 1). ) . Les deux méthodes ont suivi le protocole de séquençage ARTIC nCoV-2019⁷. Plus précisément, pour la plate-forme Ion Torrent, la connectivité de base, l’ajustement et le contrôle de la qualité ont été effectués à l’aide du pipeline intégré du logiciel Ion Reporter™. Les lectures ont ensuite été cartographiées par rapport au génome de référence Wuhan-Hu-1 (numéro d’accès GenBank : MN908947.3) à l’aide du pooler IRMA.⁸ Plug-in logiciel Ion Reporter™ (ThermoFisher Scientific, Carlsbad, Californie, États-Unis). L’appel de variables a été effectué en parallèle avec le plug-in Variant Caller pour le logiciel Ion Reporter™ et avec Snippy v.4.6.0⁹, avec les paramètres par défaut (couverture minimale de 10 fois et minimum 90 % de la fréquence allélique). Les annotations des variantes étaient basées sur le génome de référence. Le plug-in Variant Caller a également été utilisé pour rechercher des variantes secondaires. Pour filtrer ces lectures, les lectures ont été cartographiées sur la souche de référence à l’aide du logiciel Geneious Prime (version 2020.0.4, Biomatters Ltd., Nouvelle-Zélande), et les variantes ont été manuellement criblées par alignement. Toutes les variantes à faible couverture, présentes dans <15 % des lectures, situées près des extrémités des lectures (amplicons) ou ayant une faible qualité de lecture ont été rejetées. Les variables identifiées comme problématiques par De Maio et al.^dix Il a également été jeté. Pour la plateforme ABL, différentes étapes du pipeline ont été réalisées à l’aide du logiciel MicrobioChek (ABL Group SA, Luxembourg)¹¹. Les généalogies sont établies selon la carte PANGO^{1 2} et utilisation de l’application web Pangolin 2.0¹³et le plan NextStrain sur la page Web NextClade¹⁴. Toutes les séquences du SARS-CoV-2 ont été déposées dans la base de données GISAID¹⁵ (Code : h-CoV-19 / Espagne / MD-H12O).

analyses statistiques

Les variables qualitatives sont présentées sous forme de nombres et de pourcentages. Les chiffres ont été générés à l’aide de GraphPad Prism, version 6.