Isolement et identification de peptides antioxydants à partir de viande de crocodile hydrolysée par chromatographie sur gel de silice

Matériaux

crocodile (Crocodylus siamensisLa viande a été achetée au supermarché Huarun, Guangzhou, Chine. La viande a été amenée dans une glacière au laboratoire et refroidie à -20 ° C avant utilisation. Des feuilles de gel de silice G et de gel de silice (0,25 mm d’épaisseur, 100 × 100 mm ou 200 × 100 mm) ont été achetées auprès de Qingdao Marine Chemicals Co., Ltd. (Qingdao, Chine). L’étiquette protéique a été achetée chez Takara Co. (Shangai, Chine). Kumasi Brilliant Blue R-250 et G250, DPPH (radical diphényl bécrylhydrazinyle), ABTS [2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)], et BCA (acide bicinchoninique) acheté auprès de Qihuashen Co., Ltd. (Guangzhou, Chine). 2 papaïnes (2,0 x 10 .)⁵ U/g), pepsine (2,3 x 10 .)⁵ U/g), trypsine (1,5 x 10 .)⁵ U/g) et alcalase (3,0 × 10 .)⁵ U/g) de Qihuashen Co., Ltd. (Guangzhou, Chine). Les autres réactifs chimiques et biochimiques sont de qualité analytique ou biochimique et achetés auprès de fournisseurs locaux.

Préparation de protéines de viande de crocodile et de ses hydrolysats

diminuer

crocodile (Crocodylus siamensis) La viande a été découpée en petits morceaux, homogénéisée à température ambiante pendant une demi-heure puis dégraissée comme décrit par Jang et al.²³. La graisse homogénéisée a été retirée de la viande d’alligator en agitant avec de l’isopropanol (1:4, p/v) pendant 50 min à température ambiante. Après centrifugation à 700g Pendant 30 minutes, le surnageant a été jeté et le précipité a été lyophilisé dans un lyophilisateur sous forme de viande d’alligator dégraissée.

extraction de protéines

Cinq grammes de poudre de viande d’alligator dégraissée ont été extraits avec 20 ml d’eau distillée et agités pendant 10, 20, 40 ou 80 min, à température ambiante ou dans un bain-marie bouillant, puis centrifugés à 1600.g pendant 20 minutes. Le surnageant a été prélevé sous forme d’extraits protéiques pour la digestion enzymatique.

protéolyse

Les protéines d’alligator ont été hydrolysées selon les procédures décrites précédemment²⁴ Avec des modifications mineures. Des extraits protéiques équivalents à 5 g de viande de crocodile ont été dilués à 100 ml avec de l’eau distillée et zymolisés pendant 2 h à des conditions de pH et de température optimales au moyen de papaïne (pH 6,2, 37 °C), pepsine (pH 2,0, 37 °C) ), trypsine (pH 7,6, 37 °C) et callase (pH 8,0, 50 °C). L’ajout de protéase était de 2 %. Après la réaction, l’hydrolyse a été ajustée à pH 7,0 et chauffée à 97°C pendant 10 min pour inactiver les enzymes. L’hydrolyse centrifuge a été obtenue à 1600°C.g pendant 20 minutes. Le surnageant a été lyophilisé et conservé à -20°C.

Analyse des protéines

Teneur en protéines

Les teneurs en protéines ont été déterminées à l’aide du test de Bradford²⁵.

degré d’hydrolyse (DH)

Le degré d’hydrolyse des trayons aqueux a été déterminé en utilisant la méthode TNBS (acide trinitrobenzène sulfonique) décrite dans Maux et al.²⁶.

Analyses SDS-PAGE et Tricine-SDS-PAGE de protéines et de peptides

Les protéines de viande de crocodile ont été analysées en utilisant la méthode SDS-PAGE selon Babini et al.²⁷. Les gels d’empilement et de séparation étaient de 5 % et 12 %, respectivement. Tous les échantillons contenant 2 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol ont été chauffés pendant 5 min dans un bain d’eau bouillante. Dix ul de solution d’échantillon ont été chargés dans le puits d’échantillon et soumis à une électrophorèse à une tension constante de 80 V pour l’empilement du gel et de 120 V pour la séparation du gel. Le gel a été coloré avec Coomassie Brilliant Blue G-250.

L’hydrolyse a été analysée par la méthode Tricine-SDS-PAGE, selon la méthode de Li et al.²⁸. Les gels d’empilement et de séparation étaient de 4 % et 20 %, respectivement. Tous les échantillons contenant 2 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol ont été chauffés pendant 5 min dans un bain d’eau bouillante. Dix ul de solution d’échantillon ont été chargés et soumis à une électrophorèse à une tension constante de 30 V pour l’empilement du gel et de 100 V pour la séparation du gel. Le gel a été coloré avec Coomassie Brilliant Blue G-250.

Détermination des activités antioxydantes

L’activité déradicalaire DPPH a été déterminée selon la méthode de Santos et al.²⁹ Avec quelques modifications. Les échantillons ont été dilués à 3, 6, 9, 12 et 15 mg/ml avec 0,01 mol/L de tampon phosphate (pH 7,0). A 160 μl de chaque échantillon, 640 μl de 0,1 mmol/L de DPPH dans de l’éthanol ont été ajoutés (le DPPH a été dissous dans de l’éthanol à 95%). La solution a été bien mélangée et laissée à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité. Ensuite, l’absorbance de la solution a été mesurée par spectrophotométrie à 517 nm. La valeur d’absorbance de l’échantillon mélangé avec du DPPH dans de l’éthanol a été présentée comme A ._{un échantillon}. La valeur d’absorbance de l’échantillon mélangé avec une solution d’éthanol à 95 % a été présentée comme A_contrôler. La valeur d’absorption de DPPH dans l’éthanol seul a été présentée comme A_Vide. Le pourcentage d’activité de piégeage du DPPH a été calculé comme suit : Activité de piégeage des radicaux (%) =[1 − (A_sample − A_control)/A_blank]x100.

L’activité de piégeage des radicaux ABTS a été mesurée selon la méthode de Zhang et al.³⁰. En bref, une solution d’ABTS à 7 mmol/L a été bien mélangée avec une solution de persulfate de potassium à 2,45 mmol/L en quantités égales, puis la solution a été laissée pendant une nuit (12-16 h) dans l’obscurité à température ambiante. La solution ci-dessus a été diluée avec 5 mmol/L de tampon phosphate (pH 7,4) pour que l’absorption par un spectrophotomètre à 734 nm soit de 0,7 ± 0,02. Vingt μl de solution d’échantillon avec 3, 6, 9, 12 et 15 mg/mL, ont été ajoutés à 2 mL de réactif ABTS dilué, et le mélange a été laissé à température ambiante pendant 6 min à fond. Ensuite, l’absorbance a été enregistrée à 734 nm. Le vide a été préparé de la même manière, sauf que l’échantillon a été remplacé par de l’eau désionisée. Le pourcentage d’activité de piégeage des radicaux ABTS a été calculé comme suit : activité de piégeage des racines (%) = (A_Vide– une_{un échantillon})/une_Videx100.

TLC-bioautographie

Après séparation chromatographique et évaporation de la phase mobile, les feuilles de gel de silice ont été uniformément pulvérisées avec un réactif chromogène selon la méthode de Krüger et al.³¹. En pulvérisant une solution d’alcool de ninhydrine (0,5 %, p/v), des bandes peptidiques rouges sont apparues en 30 minutes à 105 °C ; En pulvérisant une solution d’alcool DPPH (0,1 %, p/v), les bandes antioxydantes sont apparues blanches pendant la nuit à température ambiante ; En pulvérisant du sulfate de cuivre (1 %, p/v), une solution aqueuse de BCA (5 %, p/v), des bandes de protéines sont apparues bleues pendant la nuit à température ambiante.

Séparation et purification de peptides

Fractionnement du poids moléculaire

L’hydrolyse a été fractionnée à l’aide de membranes d’ultrafiltration selon Abd al-Hadi et al.³² avec des films de poids moléculaire coupé (MWCO) de 3 kDa et 30 kDa. Les fractures ont été obtenues <3 كيلو دالتون ، 3-30 كيلو دالتون ،> 30 kDa. Les fractions congelées ont été cassées et conservées à -20 °C.

Séparation des peptides actifs par chromatographie sur colonne de gel de silice

La fraction active de M<3 kDa a été dissoute dans 1 ml d'eau distillée et chargée sur une colonne de silice (Φ2,7 x 40 cm). La colonne a été éluée avec des solvants 1,2-dichloroéthane/méthanol de 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 3/7, 2/8, 1/9, 0/10 et méthanol/eau 9/1, 50/50 et 0/10), par taille de lit, à un débit de 2,0 mL/min. Les fractions ont été concentrées et conservées à -20 °C jusqu'à utilisation.

Analyse et purification du peptide antioxydant par CCM .

Des échantillons ou des parties actives ont été analysés ou purifiés à partir d’une chromatographie sur colonne de silice par CCM. Des plaques de gel de silice ont été développées/lavées avec du méthanol puis activées à 105°C pendant 30 min, avant d’être utilisées pour séparer l’échantillon. Après chargement des échantillons, les plaques TLC ont été développées avec des solvants 1,2-dichloroéthane : méthanol : ammoniac 1:9:0,2 (V/V).

Identification et synthèse de peptides purifiés

Les peptides purifiés ont été identifiés par HPLC-MS chez Wininnovate (Shenzhen, Chine). Les peptides actifs identifiés ont été fabriqués par NJ peptide Company (Nanjing, Chine) pour le test d’activité.

Analyse statistique des données

Toutes les analyses quantitatives ont été répétées au moins trois fois. Les moyennes et les erreurs types sont présentées.