La nouvelle méthode Cleaver accélère l’étude technique et génétique du SRAS-CoV-2 et de ses variantes

Une étude récente publiée dans bioRxiv* Un serveur de préimpression a décrit une mutagenèse rapide et le sauvetage de variantes du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) sans clonage, en utilisant une nouvelle stratégie de génétique inverse.

Stady : Mutagenèse rapide sans clone de nouvelles variantes du SRAS-CoV-2 à l’aide d’une nouvelle plateforme de génétique inverse. Crédit image : kentoh/Shutterstock.com

*Remarque importante: bioRxiv Il publie des rapports scientifiques préliminaires qui n’ont pas été évalués par des pairs et ne doivent donc pas être considérés comme concluants, orientant la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations concrètes.

arrière-plan

Des méthodes de génétique inverse bien établies pour les coronavirus ont été adaptées au SARS-CoV-2 après son apparition. Une méthode basée sur l’ADN, les amplicons infectieux sous-authentiques (ISA), permet la recombinaison de fragments d’ADN se chevauchant transcrits dans un génome de pleine longueur, qui a été récemment adapté pour le SRAS-CoV-2.

Étude et résultats

Dans cette étude, les chercheurs ont développé et décrit une stratégie basée sur l’ISA appelée « Système sans clone et remplaçable pour l’ingénierie et le sauvetage des virus » (CLEVER), utilisant le SARS-CoV-2.

Huit fragments génomiques SARS-CoV-2 se chevauchant ont été amplifiés et transfectés dans des cellules HEK293T. La propagation résultante du virus recombinant (rCOV2) a été évaluée en observant l’effet cytopathique (CPE).

L’équipe a observé leur premier CPE cinq à huit jours après la transfection (DPT). Ils n’ont observé aucune amélioration de la récupération du virus avec la co-transfection d’un plasmide exprimant des nucléotides ou de l’ARN messager (ARNm). De plus, comme amélioration, les pièces ont été réduites de huit à quatre.

Une cellule productrice de virus pour 11 000 cellules a été observée par transfection en quatre parties, contre une pour 160 000 cellules dans huit portions de transfection.

De plus, l’équipe a testé l’effet de la transfection à l’aide de quatre fragments sur la précision de la recombinaison en comparant l’efficacité de la réplication entre les isolats de type sauvage et les virus recombinants. La taille et la forme du virus de type sauvage et du rCOV2 généré à partir de quatre fragments (rCOV2-4fr) étaient similaires.

Bien que la cinétique de réplication du rCOV2-4fr ait révélé une diminution des titres dans les 24 h suivant l’infection, les titres étaient comparables après une infection prolongée. La microscopie électronique à transmission a été utilisée pour comparer la viabilité du virion. Le rCOV2-4fr était impossible à distinguer du virus de type sauvage.

L’équipe a indiqué que le processus de reconstitution était reproductible, avec une récupération réussie du virus à partir des lignées cellulaires HEK293, HEK293T, BHK-21 et CHO.

Ensuite, l’équipe a amélioré le processus d’amplification en adoptant certaines règles, telles que l’utilisation d’une insertion de modèle ou d’une polymérase haute fidélité, la limitation des cycles d’amplification à 25 et l’assemblage de huit réactions d’amplification parallèles.

Les chercheurs ont introduit un locus de marqueur génétique (reconnaissance Sal1) pour faire la distinction entre les virus recombinants et la contamination accidentelle par des isolats cliniques. Ce marqueur était présent dans tous les virus recombinants.

De plus, l’équipe a présenté la séquence du génome des variants du SRAS-CoV-2 avec/en conservant la séquence de la souche ancestrale restante (Wuhan) comme arrière-plan.

La séquence cible (gène variable spike) a été amplifiée à l’aide de plasmides commerciaux ou endogènes. Les particules virales chimériques ont été récupérées et confirmées par séquençage.

Des virus chimériques récupérés ou des isolats cliniques de la souche Wuhan et des variants Omicron BA.1 ou BA.5 ont été soumis à des échantillons de sérum d’individus vaccinés. Le titre de neutralisation le plus élevé était contre la souche Wuhan. Les titres étaient similaires entre les virus chimériques et leurs homologues épineux.

Une étape d’amplification peut être exploitée sans mutants de nouveau Synthèse ou reproduction. L’équipe a conçu une paire d’oligonucléotides qui a inséré N501Y ou G614D. Les fragments portant ces mutations ponctuelles ont été co-transfectés avec les autres fragments nécessaires à l’assemblage du génome.

Le séquençage a confirmé l’insertion réussie des substituants. De plus, ils ont conçu des amorces oligonucléotidiques pour une délétion ORF3a, qui a été confirmée par séquençage et immunotransfert ponctuel.

En outre, l’équipe a réussi à insérer une séquence spécifique au site exogène (une étiquette triple FLAG) près de l’extrémité carboxy de l’ORF8. De plus, les chercheurs ont légèrement modifié la stratégie pour sauver directement le rCOV2 des isolats cliniques.

Ils ont cloné des éléments d’expression eucaryotes requis pour la transcription dépendante de l’ADN du génome viral ou obtenu des plasmides obtenus dans le commerce codant pour ces éléments. Tous les éléments ont été assemblés en un seul ADN de liaison.

Cent paires de bases de régions virales non traduites (UTR) 3′ et 5′ entourent le segment de liaison des deux côtés. Conçu pour une recombinaison réussie dans un produit d’ADN circulaire. Huit fragments génomiques du SRAS-CoV-2 ont été amplifiés en une seule étape à partir d’ARN viral. L’amplicon a été transféré avec le fragment de liaison. Des virus viables ont été sauvés à sept DPT.

Cela a permis le sauvetage de divers virus chimériques sans clonage bactérien. Les génomes d’isolats cliniques de la souche Wuhan SARS-CoV-2 et de ses variants Omicron (BA.1 et BA.5) ont été amplifiés.

Le fragment contenant le gène de pointe a été échangé avec des fragments correspondants portant un ou plusieurs gènes de pointe variants. Ainsi, des virus chimériques portant des gènes de pointe hétérologues ont été générés.

Enfin, l’équipe a sauvé un virus recombinant à partir d’un isolat clinique d’Omicron BA.5 comme décrit précédemment, mais en utilisant des amorces qui ont introduit une délétion ORF3a. De même, XBB.1.5 recombinant avec suppression ORF3a a été sauvé. Ainsi, les auteurs peuvent générer des mutants de délétion des variants émergents du SRAS-CoV-2 en une seule étape.

conclusions

En bref, l’approche de Cleaver était très polyvalente avec une large application pour la mutagenèse rapide ou le sauvetage du SRAS-CoV-2 sans clonage. Les auteurs ont démontré la flexibilité de cette technique en introduisant des mutations ponctuelles, des séquences étrangères ou des délétions ORF3a.

De plus, en circulant intracellulairement avec le fragment de liaison, ils ont introduit la suppression ORF3a et sauvé des recombinants fonctionnels en une seule étape de l’ARN viral.

*Remarque importante: bioRxiv Il publie des rapports scientifiques préliminaires qui n’ont pas été évalués par des pairs et ne doivent donc pas être considérés comme concluants, orientant la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations concrètes.